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超滤离心管作业工艺流程
发布时间:2020-12-25   点击次数:152次
   超滤离心管分为内管和外管的两个部分,内管中是带有一定分子量的膜,当高速离心时,分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了,分子量比它大的就截留在上面(即内管中),就是超滤的原理,常用于浓缩样品。
  超滤离心管作业工艺流程
  1、选择合适的超滤管主要考虑分子量和浓度:通常靶蛋白的分子量不应大于靶蛋白分子量的1/3。例如,当靶蛋白的分子量为35kDa时,可以选择靶蛋白分子量为10kDa的超滤管。如果靶蛋白的分子量约为10kd,则可使用分子量为3kd的超滤管。
  2、新购买的超滤是干燥的:使用前加入Milliq水。水的体积完全覆盖在膜上,冰浴或冰箱被预先冷却几分钟。倒出水后,可以加入蛋白质溶液。蛋白质添加量不超过管顶白线。超滤管在加入蛋白质溶液前需要在冰上预先冷却。
  3、平衡:质量和重心都应该平衡。注意速度和加速度不要太快,否则会直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心预冷至4度)。膜和旋转轴的方向根据说明进行调整(对于角向离心机,膜垂直于轴)。在实际应用中,一般的速度开度比手动低,可以延长离心管的使用寿命。
  4、当浓缩到剩余的1毫升时,取50μl布拉德福德溶液,加10μl流过,看是否变蓝,以判断UF管是否漏蛋白。如果管道泄漏,重新倒入上层,然后流过新管道开始超滤。为了准确确定管道是否泄漏,用5mg/mlBSA离心10分钟,然后将其穿过,大致运行胶水或Bradford,继续添加剩余的蛋白质溶液以浓缩(在冰上操作以防止蛋白质加热),直到所有浓缩物都添加完毕。离心过程中应注意是否有蛋白质沉淀,导致堵塞。如果发生沉淀,有必要确定沉淀的具体原因是蛋白质浓度过高还是缓冲液不当。前者可以通过多个超滤管同时超滤来降低浓度,而后者通过改变不同的缓冲液直到没有蛋白质沉淀。
  5、前几步是用来浓缩蛋白质的,如果要更换缓冲液,当总蛋白溶液浓缩到1毫升左右时,轻轻添加一个新的缓冲液(用0.22um超滤膜超滤后),然后连续浓缩到1毫升左右。浓缩液的终体积取决于所需的蛋白质浓度,通常不超过500ul,但也要浓缩到200ul以下。根据每次至少10次的体积浓度计算,1000次以上的3次基本可以达到更换缓冲器的目的。
  6、提取终浓缩蛋白的操作在冰上进行。黄色枪头(200ul)用于提取终的蛋白质浓缩物。枪头沿枪头边缘轻轻插入。将蛋白溶液轻轻吹匀。注意不要触摸超滤膜。吸取浓缩液,一次多吸200ul,直至耗尽。后留在管底的浓缩液不需要吸收,否则太困难,可能损坏超滤膜。后,在无超滤膜的超滤管中加入Milliq水,以防止超滤膜干燥。
  7、将超滤管中的水倒出来,用Milliq水轻轻冲洗几次。(如管底有可见蛋白质沉淀,可先加水,再用枪头吹气,注意不要碰触膜,吹气至沉淀悬浮,再倒出,不要冲自来水)然后加入0.2mNaOH溶液,室温放置20分钟,平衡超滤。在此期间定量管离心10分钟,倒出剩余的NaOH溶液,将管芯浸入Milliq烧杯(1L或2L)中。放置数小时,然后用新水替换,放置数小时,不断稀释NaOH浓度。50ml管道和盖子用自来水冲洗,内壁用Milliq水冲洗。
  8、取出浸入水中的芯,并将其加入几乎满毫升的水中。在50毫升试管中注入毫升水。慢慢地将芯放入50毫升离心管中,排出一些水。然后盖上盖子,4摄氏度存放,直到下次使用。一般来说,根据上述步骤和注意事项,每根渠道在三到四年内不会受损。
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